Блот-гибридизация

Блот-гибридизация * блот-гібрыдызацыя * blot-hybridization — гибридизация рестриктазных фрагментов исследуемой ДНК, предварительно разделенных электрофоретически и перенесенных на нитроцеллюлозный фильтр при помощи фильтровальной бумаги, со специфичным нуклеотидным зондом. Методика проведения Б.-г. состоит из нескольких этапов. 1-й этап — получение ДНК из исследуемого материала. В зависимости от вида биологического материала (ткань, кровь, молоко) методика выделения ДНК имеет специфические особенности. Главным моментом на данном этапе является депротеинизация ДНК, ее отделение от белка, осаждение и отмывание. Для одного анализа достаточно от 1 нг до 1 мкг ДНК, которые можно получить из 1 мл крови, 5-10 мг культуры клеток или организмов и т. д. 2-й этап — обработка ДНК рестриктазами (рестрикционными эндонуклеазами). Обработка происходит в стандартных условиях (при температуре 37 °С) на протяжении 3-16 ч. Вследствие гидролиза длинноцепочечная ДНК превращается в смесь коротких фрагментов. 3-й этап — нанесение смеси фрагментов ДНК на электрофоретическую пластинку с 0,8%-ным агарозным гелем и проведение электрофореза. Вследствие различной молекулярной массы фрагменты ДНК будут двигаться в электрическом поле от отрицательного полюса к положительному с различной скоростью. При этом фрагменты с меньшей М. м. движутся быстрее, чем более длинные. После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Денатурация ДНК осуществляется с помощью раствора щелочи: двухцепочечные фрагменты ДНК переходят в одноцепочечные. 4-й этап — непосредственно блоттинг (см.), или получение оттиска картины электрофореза на нитроцеллюлозном фильтре. Сразу после окончания электрофореза на пластинку агарозного геля, которая находится в буферном растворе, накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а сверху на него — несколько листов фильтровальной бумаги, и все это помещают под пресс. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля, который вместе с ДНК-рестриктами проходит через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК-фрагменты адсорбируются на фильтре строго в соответствии с их положением в геле. Таким способом получают от печаток полученных рестриктов на нитроцеллюлозном фильтре. Помимо нитроцеллюлозных фильтров используются различные нейлоновые или капроновые мембраны. Нейлоновые мембраны ковалентно связывают ДНК-фрагменты, что позволяет осуществлять их последующую регенерацию и многократное использование. Для ускорения процедуры блоттинга и его эффективности применяют вакуум и электроперенос. 5-й этап — гибридизация рестриктных фрагментов с ДНК-зондами. ДНК-цепи закрепляют на фильтре прогреванием, а далее фильтр инкубируется с меченым нуклеотидным зондом. В качестве метки в классическом варианте используют изотопные маркеры, чаще 32Р. В таком случае дальнейшая идентификация гибридов производится путем радиоавтографии. Различают несколько видов блот-гибридизации: Саузерн-блоттинг (см.) — для визуализации фрагментов ДНК; нозерн-блоттинг (см.) — для РНК; вестернблоттинг, или иммуноблоттинг, — для связывания электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с мечеными антителами. Метод авторадиографии (см.) позволяет определить положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. При длительной экспозиции (несколько дней) и высокой радиоактивности зонда (более 109 расп./(мин × мкг) метод позволяет выявлять менее чем 0,1 нг ДНК. Напр., в случае использования зонда размером в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 1000 п. н. (1 кб) выявляется в 10 мкг геномной, обработанной рестриктазами ДНК в виде четкой полосы на радиоавтографе после экспозиции в течение 12 ч. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет различать очень короткие олигонуклеотидные зонды (20 п. н.), но в таком случае требуется особо хорошее мечение и длительная экспозиция фильтра. В последнее время применяют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра.